转自：诺唯赞生物
在分子生物学中，未知基因全长序列的获取是研究新基因的重要步骤。随着研究深入，大家对实验周期、技术步骤等有了更高要求，RACE技术应运而生！
原理难理解？实验做不好？诺唯赞为大家准备了RACE技术全攻略，从实验原理、实验细节要点，到RACE常见问题的解答，助你轻松解码未知序列！
本期为RACE专题第一期——原理篇
什么是RACE？
RACE(rapid amplification of cDNA end)也叫cDNA末端快速扩增技术，是一种在已知部分cDNA序列时，通过逆转录和PCR快速克隆得到完整的cDNA的 3' 或 5' 末端的分子生物学技术。广泛应用于cDNA文库的构建及筛选、克隆已知序列的旁侧内部序列、克隆同源基因的同源片段、克隆长链非编码RNA全长、mRNA UTR区域定位等研究。
什么是Cap-swiching RACE？
目前应用较多的为Cap-swiching RACE技术，是利用逆转录酶识别RNA的5'端帽子结构后，在产生的cDNA的 3' 末端加上poly（C）；再使用接头引物与poly（C）互补配对完成模板转换。主要类型有 3' RACE和 5' RACE， 3' RACE可以得到已知序列到 3' 末端之间的全部序列，5' RACE可以得到已知序列到 5' 末端之间的全部序列。
Cap-switching 3'RACE原理是什么？
第一链cDNA的合成
① 3' CDS Primer 的 5' 端带有一段接头序列；
② 3' CDS Primer识别RNA的 3' 端 poly A尾结构，逆转录合成一链cDNA（若RNA无poly A尾，则需进行加A处理）。
PCR模块
③ 3' GSP 以第一链 cDNA 为模板合成第二链 cDNA；
④ UP - Long 带有与 3' CDS Primer 相同的接头序列，识别第二链cDNA的 3' 端，合成第三链 cDNA;
⑤ 3' GSP 以第三链 cDNA 为模板合成双链 DNA;
⑥ 3' GSP 与 UP - Short 以双链 DNA为模板进行PCR扩增。
Cap-switching 5'RACE原理是什么？
第一链cDNA的合成
① 5' CDS Primer 识别RNA 的3' 端poly A尾结构进行一链cDNA合成，若RNA无poly A尾，则可以使用5' Random Primer或5’GSP代替5' CDS Primer；
② 逆转录进行到mRNA 的 5' 端时,逆转录酶的末端转移酶活性会在cDNA的 3' 末端上加上d (C)；
③ 5' TS Oligo接头序列的 3' 末端带有poly (G)，可与cDNA末端的d (C)序列互补配对；
④ 逆转录酶继续以5' TS Oligo为模板合成cDNA，完成模板转化（Template-Switching）。
PCR模块
⑤ UP - Long 带有通用引物序列和接头序列，识别第一链cDNA 的3' 端，合成第二链 cDNA ；
⑥ 5' GSP 引物以第二链cDNA为模板合成第三链 cDNA；
⑦ UP - Short 为通用引物序列，以第三链 cDNA为模板 ，合成互补双链 DNA；
⑧ UP - Short 与 5' GSP 引物以双链 DNA 为模板进行 PCR扩增。
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会在后面几期与大家分享
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